對于血清、腹水和組織培養(yǎng)上清的澄清,離心和過濾是基本的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)。這些技術(shù)可以去除會阻塞層析柱的脂類和小顆粒物質(zhì)。對于某些 樣品,緩沖液置換和除鹽也是必要的步驟。硫酸銨沉淀作為更進(jìn)一步的預(yù)處理步驟,經(jīng)常用于濃縮腹水中的免疫球蛋白。
抗血清
多克隆抗體通常是未經(jīng)純化的,稱為血清或抗血清。抗血清是指已經(jīng)除去了凝血蛋白和血紅細(xì)胞的免疫宿主的血液。抗血清包含所有種類的 抗體/免疫球蛋白以及其它血清蛋白。它所包含的不僅有識別靶抗原的抗體,還有識別非靶抗原的抗體,在免疫分析中有時(shí)會發(fā)生非特異性反 應(yīng)。由于這個(gè)原因,粗制抗血清通常要進(jìn)行純化,以去除血清蛋白,增加能特異和靶抗原相結(jié)合的免疫球蛋白的比例。
組織培養(yǎng)上清
單克隆抗體可以通過雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)(細(xì)胞分泌性抗體)并收獲雜交瘤組織培養(yǎng)上清來獲得。
腹水
單克隆抗體可以通過在小鼠(或大鼠)的腹腔中生長雜交瘤細(xì)胞而產(chǎn)生。雜交瘤細(xì)胞注射入小鼠以后,就會在小鼠腹腔繁殖并產(chǎn)生液體(腹 水)。這種腹水就包含了高濃度的可收獲抗體,比雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)有更高的抗體產(chǎn)量。
抗體純化
多克隆抗血清或單克隆腹水/組織培養(yǎng)上清通常通過下述三種方法中的一種來進(jìn)行純化:
1. 蛋白A/G純化 蛋白 A/G 純化是應(yīng)用金葡萄球菌的蛋白 A 或鏈球菌的蛋白 G 對免疫球蛋白 Fc 段的高親和性。蛋白 A/G 純化從粗制抗血清中去除了血清 蛋白,但沒有去除非特異的免疫球蛋白組分。結(jié)果蛋白 A/G 純化的抗血清仍然具有一小部分不期待的交叉反應(yīng)性。
2. 親和純化 親和純化就是通過相似性分離某一特定蛋白或具有相似特征的一組蛋白。這種分離蛋白的技術(shù)是基于在蛋白和耦合于層析介質(zhì)上的特定配基 之間的一種可逆的相互作用。 抗原親和純化的優(yōu)勢是免疫球蛋白能夠特異性地同刺激它產(chǎn)生的抗原進(jìn)行結(jié)合,結(jié)果消除了大量的非特異免疫球蛋白成分,將能特異與靶抗 原相結(jié)合的免疫球蛋白成分富集。因此親和純化后獲得的主要是含所期待的特異性免疫球蛋白。
3. 預(yù)吸附 多克隆抗體有時(shí)要經(jīng)過預(yù)吸附。也就是說它們要被不同物種來源的其它蛋白或血清吸附,以消除可能的交叉反應(yīng)的抗體。這樣純化后的抗體 純度和特異性應(yīng)很高,任何交叉反應(yīng)都被顯著減少。
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