免疫熒光技術(shù)有兩種檢測(cè)方法：用熒光標(biāo)記抗體示蹤或檢測(cè)相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法；用已知的熒光標(biāo)記抗原示蹤或檢測(cè)相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法。其中以熒光抗體方法較常用。
1.在開(kāi)始實(shí)驗(yàn)研究前，有哪些因素需要考慮？
1.根據(jù)抗原選擇合適的抗體：確認(rèn)抗原可以識(shí)別哪一種異構(gòu)體以及抗原表位的位置。2. 確認(rèn)您的目的蛋白在該樣本中是否表達(dá)（這里需要用到陽(yáng)性對(duì)照）。3. 根據(jù)您所要研究的目標(biāo)蛋白來(lái)確定合適的樣本類型（石蠟切片、冰凍切片還是細(xì)胞制備物等）。4.選擇抗體時(shí)需要考慮該抗體的物種交叉反應(yīng)；5. 關(guān)于蛋白，您需要考慮它的組織定位和細(xì)胞定位，以及染色時(shí)是否應(yīng)該有信號(hào)。6.選擇合適的固定方法及抗原修復(fù)方法。7.抗體的工作濃度或稀釋比例，以及抗體的物種來(lái)源也是需要考慮的重要因素。
2.免疫組化實(shí)驗(yàn)里為什么要對(duì)樣品進(jìn)行處理？
樣品處理是為了調(diào)控樣本中蛋白的表達(dá)水平。如果是細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，我們可能需要使用適當(dāng)?shù)囊种苿┗蚣せ顒﹣?lái)上調(diào)或下調(diào)細(xì)胞中某種蛋白質(zhì)的表達(dá)。如果是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，我們需要考慮更多的因素，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)對(duì)象是活的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。在選擇抑制劑或激活劑、激動(dòng)劑或拮抗劑時(shí)，應(yīng)盡量避免由于非特異性結(jié)合其它蛋白所導(dǎo)致的非特異性效應(yīng)。對(duì)于某些特殊試驗(yàn)樣品，比如腦，我們需要確保細(xì)胞的滲透性，讓化合物能真正進(jìn)入細(xì)胞或血腦屏障。另外需要確保所使用的化學(xué)品能夠溶于合適的溶劑。還有確定*適合的給藥途徑（注射或口服）。完成上述所有步驟之后，您就可以獲取組織或細(xì)胞樣品了。
3.請(qǐng)問(wèn)如何根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)對(duì)象來(lái)選擇不同的樣本形式呢？
對(duì)于細(xì)胞制備物，它們常見(jiàn)的形式是涂片或培養(yǎng)的細(xì)胞系。對(duì)于組織樣本，*常用的是石蠟包埋的組織切片，福爾馬林固定。原因是它們能夠保持組織形態(tài)與蛋白抗原性之間的*佳平衡。石蠟包埋的組織切片很穩(wěn)定，并且易于使用。但它的不足之處是很耗時(shí)（需要對(duì)切片進(jìn)行脫蠟處理和抗原修復(fù)）。一般來(lái)說(shuō)，石蠟切片適用于 4 微米厚的切片。如果切片厚度大于4微米，抗體可能會(huì)被困住，導(dǎo)致假陽(yáng)性染色，這是我們需要避免的。
另一種常見(jiàn)的樣本形式是冰凍組織切片（IHC-FR），這對(duì)于不能經(jīng)受醛固定處理和石蠟處理的抗原來(lái)說(shuō)非常理想。因此這些抗原將呈現(xiàn)出更天然的狀態(tài)。但冰凍切片的缺點(diǎn)是組織形態(tài)可能不佳，與石蠟切片相比，冰凍切片可能沒(méi)那么好看。冷凍切片通常也僅適用于厚度為 4 到 10 微米的薄切片，超過(guò)這個(gè)厚度的切片可能會(huì)困住抗原，導(dǎo)致假陽(yáng)性染色結(jié)果。如果您所要研究的組織類型無(wú)法做成這種厚度的薄切片，可以考慮采用漂片。該技術(shù)一般用于腦組織和脊髓，在發(fā)育研究中，這是一項(xiàng)非常有用的技術(shù)。該技術(shù)可用于厚度達(dá) 40 微米的更大切片。它的缺點(diǎn)是操作起來(lái)更加不便，整個(gè)過(guò)程中組織樣品都處于自由漂浮狀態(tài)，*后還必須將它們固定在載玻片上進(jìn)行觀察，操作有一定的難度。它的另一個(gè)缺點(diǎn)就是非常耗時(shí)，尤其是應(yīng)用于神經(jīng)科學(xué)研究時(shí)，動(dòng)物用 BFA 灌注，這顯然也是有難度的一步。
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