ELISA方法現(xiàn)在已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于各種抗原和抗體測(cè)定。拋開試劑盒本身質(zhì)量外，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中也有很多因素都會(huì)影響試驗(yàn)的正常結(jié)果。其中常出現(xiàn)的問題是顯色淡，靈敏度偏低、重復(fù)性不佳、假陽性結(jié)果和假陰性結(jié)果，不管出現(xiàn)什么樣的結(jié)果都會(huì)直接影響我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。今天我們一起來分析ELISA實(shí)驗(yàn)非正常檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生的常見原因，并分析其解決辦法，以提高檢測(cè)質(zhì)量。
一、顯色淡，靈敏度偏低
1、試劑盒在運(yùn)輸途中時(shí)間太長(zhǎng)，溫度太高；所以盡量縮短運(yùn)輸時(shí)間，夏季應(yīng)放冰塊降溫
2、試劑盒未充分平衡；所以試劑盒從2～8℃冰箱取出后打開盒蓋，于室溫平衡至少20分鐘，確保所有試劑已平衡至室溫（約25℃）。
3、培養(yǎng)箱溫度不足37℃，應(yīng)注意培養(yǎng)箱溫度，放入反應(yīng)板后盡量減少開啟次數(shù)以免影響溫度恒定，非隔水式培養(yǎng)箱尤其應(yīng)注意。
4、保溫時(shí)間不足；所以做實(shí)驗(yàn)時(shí)一定注意時(shí)間的重要性，如果怕忘了時(shí)間，可以校正定時(shí)鐘準(zhǔn)確定時(shí)。
5、洗滌時(shí)沖擊力太大、浸泡時(shí)間過長(zhǎng)、洗滌次數(shù)增加；按說明書要求保留洗滌時(shí)間，準(zhǔn)確記住洗滌次數(shù) 。
6、移液器吸液量不足，吸嘴內(nèi)壁掛水太多或內(nèi)壁不清潔；所以保證校正移液器，吸嘴要配套，裝吸嘴時(shí)要緊密，吸嘴內(nèi)壁要清潔，一次性使用。
7、蒸餾水，水質(zhì)有問題，要使用新鮮合格的蒸餾水。
二、重復(fù)性較差，經(jīng)常有客戶反饋說做了兩個(gè)復(fù)孔值相差太大。
1、樣品數(shù)量多少不一，加樣時(shí)間有長(zhǎng)有短；所以重復(fù)某一樣品時(shí)，加樣時(shí)間盡可能與次接近。
2、保溫時(shí)間不一致，洗滌條件不一致，操作人員不一致；重復(fù)測(cè)定標(biāo)本，操作條件、人員等應(yīng)盡可能與上次保持一致，以排除這些因素造成的不一致的可能性。
3、加樣量不一致；樣品稀釋前應(yīng)充分混勻，盡可能使用同一移液器并裝緊吸嘴。
三、假陽性結(jié)果和假陰性結(jié)果
1、標(biāo)本的采集與保存
當(dāng)標(biāo)本采集保存不當(dāng)產(chǎn)生溶血時(shí)，紅細(xì)胞中的血紅蛋白釋放到血清中，血紅蛋白具有過氧化物酶的性質(zhì)，其通過吸附或“PP效應(yīng)"（蛋白質(zhì)間相互吸附的現(xiàn)象）結(jié)合后，可催化A、B液顯色而造成假陽性。
標(biāo)本采集保存不當(dāng)致細(xì)菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，會(huì)產(chǎn)生假陽性反應(yīng)；標(biāo)本在冰箱中保存時(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致血清IgG聚合，易使間接法的試驗(yàn)本底加深。因此，標(biāo)本宜在新鮮時(shí)檢測(cè)。
反復(fù)凍融血清會(huì)使抗體效價(jià)跌落，所以測(cè)抗體的血清標(biāo)本如需保存做多次檢測(cè)，宜少量分裝凍存。
2、加樣
如果 樣品稀釋液少加或血清多加，都會(huì)引起本底增高。對(duì)于間接法來說，受上述兩個(gè)因素影響更大。因?yàn)檠逯惺軝z的特異性IgG只占IgG中的一小部分。IgG的吸附性很強(qiáng)，非特異性IgG可直接吸附到固相載體上，有時(shí)也可吸附到包被抗原的表面。這些非特異性的IgG均可以和酶標(biāo)二抗發(fā)生反應(yīng)而造成較高陰性本底或假陽性。如果加入的血清過多，高于規(guī)定的稀釋倍數(shù)，極易造成高值陰性。反之，造成假陰性。
如果加入的酶結(jié)合物過多或加在較高的孔壁上或孔口，也會(huì)引起本底升高或假陽性。
如果血液未開始凝固或凝固不*時(shí)就強(qiáng)行離心分離血清，此時(shí)的血清中仍留部分纖維蛋白原，在ELISA測(cè)定過程中可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊，易造成假陽性結(jié)果。
3. 溫育
由于ELISA試驗(yàn)在一定溫度下的反應(yīng)時(shí)間并不是反應(yīng)的終點(diǎn)，溫育時(shí)間過短、溫度過低，易致顯色不全；溫育時(shí)間過長(zhǎng)、溫度過高，易致非特異性結(jié)合緊附于反應(yīng)孔周圍，難以清洗*，產(chǎn)生陰性高值或假陽性反應(yīng)。因此，要嚴(yán)格按規(guī)定的溫度和溫育時(shí)間進(jìn)行。
由于水浴較難將溫度控制在穩(wěn)定的范圍，因此我們每次試驗(yàn)時(shí)應(yīng)認(rèn)真觀察水浴箱的溫度，盡量少開啟水浴箱門，嚴(yán)格控制水浴的溫度為37±0.5。同時(shí)，微孔板不可重疊放置，以保證傳熱均勻，各板的溫度都能迅速達(dá)到平衡。
由于試劑盒通常設(shè)定的反應(yīng)溫度為37度，在這個(gè)溫度下溫育一定時(shí)間，蒸發(fā)的水分會(huì)很多，對(duì)于整個(gè)反應(yīng)體系來講，各種反應(yīng)物的濃度會(huì)不斷地增加，這樣必會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)后的值升高。因此溫育時(shí)應(yīng)貼上封板膠。
4. 洗板
洗板在ELISA過程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟，但卻是決定試驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。ELISA就是靠洗板來達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的，通過洗板以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應(yīng)過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗板時(shí)應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來。在ELISA操作中，洗滌是主要的關(guān)鍵技術(shù)，應(yīng)嚴(yán)格按要求洗滌。洗板如不*，有酶結(jié)合物的非特異性吸附，將使空白值升高。另外，在間接法中如血清標(biāo)本內(nèi)的非特異性IgG吸附在固相上而未被洗凈，也將與酶標(biāo)記抗體作用而產(chǎn)生干擾。
洗液應(yīng)按規(guī)定的倍數(shù)稀釋使用。試劑盒提供的洗液是濃縮的，過多稀釋洗液，會(huì)影響洗液的效果，而使反應(yīng)的本底升高。反之造成假陰性。
稀釋洗液的水應(yīng)該是新鮮的蒸餾水，電導(dǎo)率小于1.5us/cm。如果水中含有過多的鈣、鎂離子，這些離子會(huì)占用表面活性劑，使試驗(yàn)本底增高。
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