己烯雌酚類(lèi)檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)（酶聯(lián)免疫法）
 
1 原理及用途
己烯雌酚是甾類(lèi)同化激素，被大量用于促進(jìn)反芻動(dòng)物的生長(zhǎng)。但由于己烯雌酚存在明顯的致癌性，歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家已相繼禁止或嚴(yán)格禁止使用。我國(guó)農(nóng)業(yè)部第235號(hào)文件中規(guī)定，動(dòng)物源性食品中己烯雌酚的殘留*為不得檢出。
本試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)尿樣、組織、飼料等樣本中的己烯雌酚（Diethylstilbestrol，DES），試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板、酶標(biāo)記物、抗體、標(biāo)準(zhǔn)品及其他配套試劑組成。檢測(cè)時(shí)，加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液，樣本中的己烯雌酚和酶標(biāo)板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗己烯雌酚抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含己烯雌酚含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)比較即可得出樣本中己烯雌酚的殘留量。
2 己烯雌酚類(lèi)檢測(cè)試劑盒技術(shù)指標(biāo)
2.1 試劑盒靈敏度：0.1ppb(ng/ml)
2.2 反應(yīng)模式：37℃，30min～30min～15min
2.3 檢測(cè)下限：
組織（蝦、魚(yú)）………………………0.2ppb
豬肉/肝、雞肉/肝……………………2ppb
配合飼料………………………………10ppb
濃縮/預(yù)混飼料………………………20ppb
尿液……………………………………0.6ppb
2.4 交叉反應(yīng)率：
己烯雌酚………………………………100%
雙烯雌酚………………………………38.5%
己烷雌酚………………………………8.5%
己炔雌二醇……………………………<0.1%
雌三醇…………………………………<0.1%
 2.5 樣本回收率：
尿     樣   ……………………… 70%±10%
組     織   ……………………… 85%±10%
飼     料   ……………………… 90%±10%
3 試劑盒組成
酶標(biāo)板……………………………96孔
標(biāo)準(zhǔn)品：各1ml
0ppb、0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb
酶標(biāo)記物（紅蓋）…………………11ml
抗體工作液（藍(lán)蓋）………………5.5ml
底物液A（白蓋）……………………6ml
底物液B（黑蓋）……………………6ml
終止液（黃蓋）………………………6ml
20X濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml
5X復(fù)溶液（黃蓋）…………………50ml
說(shuō)明書(shū)………………………………1份
4 需要的器材和試劑
4.1 儀器：酶標(biāo)儀、打印機(jī)、均質(zhì)器 、氮?dú)獯蹈裳b置、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量0.01g）
4.2 微量移液器：?jiǎn)蔚?0µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl
4.3 試劑：乙腈、氫氧化鈉、丙酮、濃磷酸（含量85%）
5 樣本前處理
5.1 樣本處理前須知：
實(shí)驗(yàn)器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
5.2 配液：
配液1：6M H3PO4 溶液
100ml 濃H3PO4（含量85%）加去離子水150ml混合均勻。
配液2：2M NaOH溶液
    8gNaOH加去離子水100ml溶解。
配液3：1M NaOH溶液
    4g NaOH加去離子水100ml溶解。
配液4：乙腈-丙酮混合液
    V乙腈：V丙酮=4:1
配液5：復(fù)溶液
    將5×復(fù)溶液用去離子水5倍稀釋?zhuān)糜跇颖镜膹?fù)溶，復(fù)溶液在4℃環(huán)境可保存一個(gè)月。
5.3 樣本前處理步驟：
5.3.1 組織（雞、鴨、豬肉/豬肝、蝦、魚(yú))樣本處理方法 
1）稱(chēng)取2±0.05g勻漿后的樣本，加入6ml乙腈-丙酮混合液，振蕩2min，15℃4000r/min離心10min； 
2）取3ml上清液，60℃氮?dú)?空氣吹干； 
3）加入0.5ml，振蕩20s，加入2ml 2M NaOH，振蕩30s，4000r/min離心5min； 
4）取上清液1ml，加入200µl 6M H3PO4，振蕩5s； 
5）加入3ml乙腈萃取，振蕩2min，室溫4000r/min離心10min，取上層有機(jī)相，60℃氮?dú)?空氣吹干； 
6）用1ml樣本復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，振蕩混勻30s。
不同樣本按如下方法稀釋?zhuān)?nbsp;
A）蝦魚(yú)：直接取50µl水相用于檢測(cè)。 
    樣本稀釋倍數(shù)：2    檢測(cè)下限：0.2ppb
B）豬肉/肝、雞肉/肝：取50µl水相加入450µl樣本復(fù)溶液，振蕩混合30s；取50µl用于檢測(cè)。
    樣本稀釋倍數(shù)：20    檢測(cè)下限：2ppb
5.3.2 飼料樣本處理方法 
1）稱(chēng)取2±0.05g搗粹后的飼料樣本，加入8ml乙腈，振蕩2min，15℃ 4000r/min離心10min； 
2）取2ml上清液，60℃氮?dú)?空氣吹干； 
3）加入0.5ml，振蕩20s，加入2ml 1M NaOH，振蕩30s，4000r/min離心5min； 
4）取1ml上清液，加入100µl 6M H3PO4，振蕩5s；
不同樣本按如下方法稀釋?zhuān)?nbsp;
A）配合料：取50µl，加入950µl樣本復(fù)溶液，振蕩混勻30s，取50µl 用于檢測(cè)。
    樣本稀釋倍數(shù)：100    檢測(cè)下限：10ppb
B)濃縮料/預(yù)混料：取25µl，加入975µl樣本復(fù)溶液，振蕩混勻30s，取50µl 用于檢測(cè)。
    樣本釋倍數(shù)：200    檢測(cè)下限：20ppb 
5.3.3 尿樣樣本處理方法 
1）取2ml尿液到離心管中，室溫4000r/min離心10min，直至清亮； 
2）移取1ml清亮尿液至離心管中，加入1ml 1M NaOH強(qiáng)烈振蕩5min； 
3）加入100µl 6M H3PO4，振蕩30 s； 
4）再加入8ml進(jìn)行萃取，振蕩5min。15℃4000r/min離心10min； 
5）去掉上層的水相，取下層有機(jī)相4 ml，60℃氮?dú)獯蹈桑?nbsp;
6）用3ml樣本復(fù)溶液干燥的殘留物，混合30s；
7）取50µl用于分析。 
    樣本稀釋倍數(shù)：6    檢測(cè)下限：0.6ppb
6 酶聯(lián)免疫試驗(yàn)步驟
   將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時(shí)可能會(huì)有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。
實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，用去離子水將20×濃縮洗滌液按20倍稀釋成工作洗滌液。
6.1 編    號(hào)：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
6.2 加樣反應(yīng)：加標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用液或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加抗體工作液50µl/孔，輕輕振蕩5秒混勻，37℃避光反應(yīng)30分鐘。
6.3 洗    滌：將孔內(nèi)液體甩干，用工作洗滌液250µl/孔充分洗滌5次，每次間隔30秒，zui后用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
6.4 加酶反應(yīng)：加酶標(biāo)記物100µl/孔，37℃避光反應(yīng)30分鐘。
6.5 洗    滌：同上
6.6 顯    色：加底物液A 50µl/孔，再加底物液B 50µl/孔，輕輕振蕩5秒混勻，37℃避光顯色15分鐘。
6.7 終    止：加終止液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，終止反應(yīng)。
6.8 測(cè)吸光值：用酶標(biāo)儀于450nm處測(cè)定每孔吸光度值（建議用雙波長(zhǎng)450/630nm）。測(cè)定應(yīng)在終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成。
7 結(jié)果分析
7.1 百分吸光率的計(jì)算
    標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以*個(gè)標(biāo)準(zhǔn)液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即
 百分吸光度值（%）＝
A
×100%
A0
A—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
A0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制與計(jì)算
   以標(biāo)準(zhǔn)液百分吸光率為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)液濃度（ppb）的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)液的半對(duì)數(shù)曲線(xiàn)圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測(cè)物的實(shí)際濃度。
   若利用試劑盒專(zhuān)業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（索?。?br />8 注意事項(xiàng)
8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒(méi)有回到室溫（25℃）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
8.2 在洗板過(guò)程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)不成線(xiàn)性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
8.3 混合要均勻，洗板要*，在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的*性。
8.4 在所有孵育過(guò)程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線(xiàn)照射。
8.5 不要使用過(guò)了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號(hào)試劑盒中的試劑。
8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個(gè)單位（A450nm< 0.5 ）時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。
8.7 反應(yīng)終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。
9 貯藏及保存期
儲(chǔ)藏條件：試劑盒于2-8℃保存，避免冷凍。
保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見(jiàn)包裝盒。